Sumários
TP 12 : Projecto: wrap-up
12 Dezembro 2024, 10:00 • Patricia Beldade
Trabalho de grupo: continuação da elaboração de um projecto de investigação científica que use marcadores genéticos e preparação da apresentação.
T 24 : Base genética de características fenotípicas
10 Dezembro 2024, 15:30 • Patricia Beldade
O mapa genótipo-fenótipo. Métodos para identificar a base genética de características fenotípicas. Selecção artificial, cruzamentos controlados, perfis de expressão genética, mapeamento genético, mutant screens, testes funcionais com mutantes KO, RNAi ou edição via CRISPR-Cas9. Estudos da base genética da adaptação usando diferentes métodos baseados em marcadores genéticos.
TP 12 : Projecto: wrap-up
9 Dezembro 2024, 14:00 • Patricia Beldade
Trabalho de grupo: continuação da elaboração de um projecto de investigação científica que use marcadores genéticos e preparação da apresentação.
T 23 : Uso de NGS no seguimento de infecções e epidemias
5 Dezembro 2024, 12:30 • Patricia Beldade
Várias epidemias e pandemias na História da humanidade. Exemplo da utilização de análise genética durante a COVID-19. Detecção e seguimento de infecções por SARS-CoV-2, virus de RNA com um genoma de cerca de 30 mil bases (30 Kb).
1) Testes de diagnóstico de SARS-CoV-2 usando “quantititive real-time PCR” (qPCR). Material biológico isolado de pessoas (maioritariamente com zaragatoa intra-nasal mas também saliva) em que o vírus é neutralizado quimicamente antes de o RNA ser extraído (de forma automotizada e robotizada) nos laboratórios de diagnóstico. Protocolo em “one step”, com passagem de RNA a cDNA (com a enzima Reverse Transcriptase) seguida da amplificação do DNA (por qPCR), num mesmo tubo. Usam-se “primers” de PCR para material viral (e para gene humano como controlo) e detecta-se amplicões através da fluorescência emitida por “region-specific probes” (no caso dos laboratórios de diagnóstico certificados na Europe, usam-se 3 “probes” contra diferentes genes virais). Critérios de detecção baseados em valores de CT para as diferentes “probes”. Caso de “drop-out” em que uma das “probes” não funciona podem reflectir uma variante do vírus (e.g. “drop-out” nas variantes Delta e Omicron).
2) Seguimento da origem e grupos de transmissão do SARS-CoV-2 usando técnicas de NGS (Nanopore e Illumina) e uma estratégia de amplificação do genoma viral via duas PCR multiplex cada uma com 49 pares de “primers” intercalados. Obtenção do primeiro genoma viral com recursos a RNA-seq e uma estratégia que enriquecia o RNA viral em detrimento do RNA do hospedeiro. Houve muita optimização de protocolos e consegue-se agora ir de zaragatoa a genoma viral em 6hr. Duas estratégias para lidar (bioinformaticamente) com as “reads” resultantes de sequenciação de novas amostras: “mapping” (contra o genoma de referência) ou “assembly” (“de novo”). Organização do genoma viral, taxa de mutação e identificação de “clusters”, incluindo estudos em Portugal. O que define uma nova variante: conjunto de mutações com particular enfoque no gene que codifica a proteína Spike do vírus. Nomenclatura das variantes. Interacção entre a Spike viral o o receptor humano Ace2. Plataformas públicas de armazenamento e visualização dos dados de sequência do genoma viral. Ainda que o esforço tenha abrandado, continua a fazer-se sequenciação de SARS-CoV-2 para detecção de novas variantes e vigilância de novas mutações. Interessa também saber se as variantes virais diferem na interacção com o hospedeiro. Lidar com a enorme quantidade de dados gerados permanece um desafio. computacional
Exibição e explicação do MiniOn, sequenciador Nanopore portátil que produz até 50 Gb de sequências que podem ir sendo seguidas directamente num computador. Este tipo de aparelho está a ser usado em vários projectos NGS do IGC. Exemplo 1: Xylella fastidiosa: bactérias patogénica em plantas. Sequenciação do genoma para detecção de espécies – revelou-se mais rápido que o teste diagnóstico com PCR. Exemplo 2: Resistência de plasmódio a fármacos anti-malária. Exemplo de “real-time adaptitive sampling” em que poros cuja sequência é identificada como humana são parados, enriquecendo-se para sequência do plasmódio, cujo genoma é significativamente menor do que o humano. Sem a técnica de enriquecimento, obter-se-iam muitas mais reads de humano do que de plasmódio. Ao contrário da tecnologia Illumina que gera short-reads e tem uma taxa de erro de cerca de 0.1% (i.e. 1 erro em cada 1000 bp), a tecnologia Nanopore gera long-reads e tem uma taxa de erro que hoje em dia já está perto dos 2% (i.e. 2 erros em cada 100 bp). Apesar da taxa de erro relativamente elevada, a sequência gerada é o consenso dum elevadíssimo número de reads e isso permite descartar grande parte dos erros.
Aula lecionada pelo convidado, especialista em DNA sequencing & analysis, Doutor Ricardo Leite, coordenador da Unidade de Genómica do (agora extinto) Instituto Gulbenkian de Ciência.
TP 11 : Projecto: preparação
5 Dezembro 2024, 10:00 • Patricia Beldade
Trabalho de grupo: planeamento de um projecto de investigação científica que use marcadores genéticos.