Sumários

O Regulador Pleiotrópico SCO1897 em Streptomyces coelicolor

20 Maio 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

O objetivo principal desta aula foi dar uma ideia da relevancia teórica e prática do conhecimento do metabolismo primário e secundário dos organismos.

Professor convidado: Angel Manteca, Universidad de Oviedo, Espanha

Hoje explorámos como Streptomyces, um género bacteriano central para a biotecnologia e a descoberta de antibióticos, integra a regulação do metabolismo e do ciclo de vida com a homeostase do fósforo, abordando as implicações do regulador SCO1897.

1. Streptomyces: importância e ciclo de vida

Começámos por relembrar que Streptomyces é a principal fonte de antibióticos, antitumorais e outros bioativos; cerca de dois terços dos compostos secundários comerciais vêm deste género.

  • O ciclo de vida de Streptomyces envolve crescimento vegetativo, morte celular programada e diferenciação em hifas aéreas e esporos.

  • A produção de metabolitos secundários, incluindo antibióticos, está fortemente acoplada ao desenvolvimento multicelular e a sinais do ambiente, como o fósforo.

2. Descoberta de antibióticos e "innovation gap"

Explicámos que, apesar do “boom” histórico da descoberta de antibióticos, existe um “innovation gap” desde os anos 1960 — poucas novas classes foram descobertas.

  • Um desafio biotecnológico é ativar vias biossintéticas "silenciosas" presentes nos genomas, potencialmente através de manipulação do ciclo de vida e da regulação.

3. Regulação por fósforo e papel do SCO1897

A aula focou depois a relação entre homeostase do fósforo e desenvolvimento.

  • Fósforo é essencial à diferenciação e à produção de compostos secundários.

  • Estudámos o regulador SCO1897, do tipo DeoR, identificado como repressor transcricional pleiotrópico.

  • Mutantes para SCO1897 mostraram bloqueio da produção de antibióticos, alterações no ciclo de esporulação, germinação e acumulação de fósforo em esporos.

4. Funcionamento do SCO1897 e interação com sistemas de transporte de fósforo

  • SCO1897 regula diretamente um cluster de genes associados a transportadores de fósforo.

  • Demonstrámos, com análise transcriptómica, que a mutação em SCO1897 afeta mais de 1.400 genes, alterando profundamente vias metabólicas, diferenciação, esporulação e produção de compostos secundários.

  • A regulação do fósforo por SCO1897 é independente do sistema clássico PhoP, mas interage através de genes em comum.

5. Efeitos no desenvolvimento e metabolismo especializado

  • O SCO1897 mostrou ser crucial para que a bactéria module o metabolismo especializado (antibióticos, pigmentos, sideróforos), consoante a disponibilidade de fósforo.

  • Observou-se bloqueio da produção de antibióticos clássicos como o actinorrodina em mutantes para SCO1897.

6. Potenciais aplicações biotecnológicas

  • Discutimos a possibilidade de manipular SCO1897 e os seus caminhos regulatórios para ativar rotas biossintéticas “silenciosas” e promover a descoberta de novos bioativos.

  • Estratégias que alteram a homeostase do fósforo podem ser usadas para otimizar a produção de antibióticos e outros metabolitos de interesse.

7. Conclusões

Finalizámos sublinhando que SCO1897 atua como um nodo central a integrar sinais ambientais (fósforo) com desenvolvimento e metabolismo especializado, sendo um alvo promissor para biotecnologia e medicina.

Dinâmica Conformacional do Canal de Potássio KcsA — Homo-FRET

19 Maio 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

O objetivo principal desta aula é explicar aos estudantes um importante fenómeno de fluorescência (anisotropia) que pode ser utilizado para estudar o comportamento e as interações de moleculas in vitro.

Professora convidada: Ana Coutinho, FCUL

Hoje explorámos como se pode estudar a dinâmica conformacional de canais iónicos, nomeadamente o KcsA, um canal de potássio procariótico, por técnicas de homo-FRET, uma abordagem que permite visualizar alterações estruturais em proteínas em solução.

1. Introdução: Canais Iónicos e FRET

Começámos por abordar as funções dos canais iónicos (com destaque para canais de potássio) e a importância do seu estudo, quer para a fisiologia quer para a farmacologia.

  • Explicámos o princípio do FRET (Förster Resonance Energy Transfer), diferenciando hetero-FRET (entre fluoróforos distintos) de homo-FRET (entre fluoróforos idênticos).

  • Discutimos que a homo-FRET é particularmente útil para estudar a proximidade e orientação entre resíduos idênticos marcados, com a leitura baseada na anisotropia da fluorescência (despolarização pós-excitação).

2. Estrutura e funcionamento do canal KcsA

  • O KcsA é um canal homotetramérico prototípico de potássio de bactérias, com alta analogia estrutural aos canais eucarióticos mais complexos.

  • Focámos as regiões-chave: filtro de seletividade (sequência TVGYG), portão de ativação (regulado pelo pH), e resíduos críticos como W67, envolvido na chamada “tríade de inativação”.

  • O canal alterna entre estados abertos (condutivos), fechados, e inativados (onde a passagem de iões é bloqueada).

3. Aplicação da Homo-FRET ao estudo do KcsA

Explicámos a estratégia experimental:

  • Engenheira-se mutantes do KcsA com um único triptofano (W67) como repórter fluorescente — isto elimina outros triptofanos para garantir especificidade de leitura.

  • Mede-se a anisotropia da fluorescência sob diferentes condições (pH, concentrações de iões, mutações).

4. Descrição das experiências e dos resultados principais

  • Os ensaios permitiram determinar a distância lateral W67-W67 entre subunidades do canal, através do ajuste de modelos matemáticos à variação de anisotropia ao longo do tempo.

  • Mostrou-se que a conformação do filtro de seletividade depende fortemente da ocupação média por iões potássio — a distância entre resíduos muda consoante o número de iões presentes.

  • Por comparação com modelos cristalográficos (incluindo canais com fragmentos Fab cristalográficos), demonstrou-se que a conformação real, em solução, é mais plástica e dependente do ambiente do que sugerido por estruturas estáticas.

5. Papel das mutações e dos ambientes iónicos

  • Mutantes como E71A (eliminando uma parte da tríade de inativação) “congelam” o canal em conformações condutivas, evidenciando o mecanismo pelo qual a inativação é controlada.

  • Variações de pH e tipos de ião (Na+, Cs+, Rb+, TBA+) também afetam a conformação do filtro de seletividade.

6. Implicações fisiológicas e técnicas

  • Ficou claro que a plasticidade conformacional do filtro de seletividade está associada à funcionalidade do canal, incluindo processos de inativação (“C-type inactivation”) e seletividade iónica.

  • A homo-FRET provou ser uma ferramenta poderosa para monitorizar estados conformacionais dinâmicos, explorando as alterações da proteína à escala de Angstroms.

7. Conclusões e perspetivas

  • A aplicação de técnicas como homo-FRET é crucial para compreender mecanismos moleculares que não podem ser captados por cristalografia de alta resolução sozinha.

  • Estes conhecimentos ajudam a desenhar futuros fármacos direcionados e a perceber doenças associadas a canais iónicos.

TP8

14 Maio 2025, 12:30 • Francisco Rodrigues Pinto

Análise de controlo metabólico (continuação da aula anterior).

TP8

13 Maio 2025, 15:30 • Francisco Rodrigues Pinto

Análise de controlo metabólico (continuação da aula anterior).

Investigar o Envelhecimento através das Síndromes Progeroides

13 Maio 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

O objetivo desta aula foi aprofundar nas consequências de alterações nos sistemas de sinalização celular, neste caso no contexto do envelhecimento.

Professora convidada: Clea Bárcena, Universidad de Oviedo

Hoje explorámos como síndromes raras de envelhecimento prematuro — as síndromes progeroides — servem de modelo para compreender os mecanismos de envelhecimento e identificar potenciais alvos terapêuticos.

1. O envelhecimento como acumulação de danos

Começámos por discutir que o envelhecimento resulta do acumular de lesões genéticas e ambientais no ADN: quebras simples e duplas, danos em bases, lesões volumosas, entre outros.

  • Diferentes sistemas de reparação (BER, NER, MMR, HR, NHEJ) atuam para corrigir estes danos e manter a estabilidade do genoma.

  • Quando estes mecanismos falham, ocorrem mutações, contribuindo para o envelhecimento e doenças associadas.

2. Síndromes progeroides – modelos humanos de envelhecimento acelerado

A aula ilustrou o contraste entre envelhecimento normal e precoce:

  • Doenças como a Síndrome de Werner, Bloom, Cockayne, HGPS (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) ou NGPS (Néstor-Guillermo Progeria Syndrome) apresentam envelhecimento acelerado devido a defeitos em mecanismos fundamentais (reparação do ADN ou estrutura nuclear).

  • Focámos dois grandes grupos:

    • Defeitos de reparação do ADN: levam a mutações, envelhecimento precoce em adultos e risco elevado de cancro.

    • Defeitos na lamina nuclear (laminopatias): acumulam proteínas anómalas no núcleo e causam envelhecimento prematuro em crianças, sem aumento de cancro.

3. Detalhes moleculares — Progeria HGPS e NGPS

Fomos ao detalhe de duas síndromes:

  • HGPS: causada por mutações no gene LMNA que levam à produção da proteína anómala progerina, com graves consequências à arquitetura nuclear, crescimento, metabolismo, ossos e sistema cardiovascular. Os pacientes têm uma expectativa de vida de cerca de 15 anos.

  • NGPS: associada a mutações em BANF1 (BAF), resultando numa proteína nuclear defeituosa. O quadro clínico inclui crescimento retardado, alterações ósseas e cutâneas, mas sem as complicações metabólicas e cardiovasculares severas da HGPS. Primeira síndrome progeroide autossómica recessiva conhecida.

4. Modelos animais e impacto nas vias celulares

Mostrei dados de estudos em ratinhos geneticamente modificados para NGPS (mutação A12T em BANF1):

  • Estes animais apresentam perda de peso, defeitos nucleares e acentuada fragilidade óssea, evocando características da osteogénese imperfeita.

  • Foi demonstrado, por análise da expressão génica no osso, que há ativação de vias de inflamação, diferenciação óssea defeituosa e sinais de envelhecimento acelerado.

  • O modelo murino é crucial para testar terapias e perceber o impacto sistémico destas mutações.

5. Implicações para a compreensão do envelhecimento humano

A aula reforçou que o estudo destas síndromes permite identificar vias comuns ao envelhecimento normal, como:

  • Instabilidade do genoma.

  • Disfunção das laminares nucleares.

  • Alterações metabólicas e inflamatórias.

  • Diminuição da renovação e reparação tecidular.
    A manipulação de alguns destes fatores mostrou potencial para retardar o envelhecimento em modelos animais (por ex., fármacos como estatinas ou bisfosfonatos, restrição

6. Terapias experimentais e desafios futuros

Concluímos salientando os avanços experimentais:

  • Uso de morfolinos, CRISPR para corrigir mutações genéticas.

  • Fármacos dirigidos à via da progerina (FTIs), ou ao metabolismo ósseo (bisfosfonatos), com algum sucesso em prolongar a saúde dos modelos animais.

  • A grande dificuldade é traduzir estes avanços para terapias eficazes em humanos — e distinguir o que é típico de uma doença rara versus processos universais de envelhecimento.