Exame TPs desenho de ferramentas moleculares

12 Maio 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

TP3: Construção de um sistema FRET

7 Maio 2025, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Na terceira TP de sinalização celular, os estudantes avançaram mais na construção de plasmídeos de expressão mais complexos, para reafirmar conceitos como a utilização dos enzimas do local de clonagem múltipla, a necessidade de manter a grelha de leitura ao longo do todo o cistrão, a necessária ausência de codões STOP dentro dos constructos, etc… Combinamos este exercício com o desenho de um par FRET para analisar as interações entre proteínas. Os estudantes produziram um sistema bicistronico FRET, no qual fusionaram duas proteínas de interesse (STAT3 e STAT1) com duas proteínas fluorescentes que eram um par FRET. Entre as duas proteínas de fusão meteram uma sequência autoclivável P2A, o que permitiria expressar as duas proteínas de fusão a partir do mesmo promotor e do mesmo plasmídeo. Os estudantes terminaram o trabalho em casa, e entregaram-o no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.

TP3: Construção de um sistema FRET

6 Maio 2025, 15:30 • Federico Herrera Garcia

Na terceira TP de sinalização celular, os estudantes avançaram mais na construção de plasmídeos de expressão mais complexos, para reafirmar conceitos como a utilização dos enzimas do local de clonagem múltipla, a necessidade de manter a grelha de leitura ao longo do todo o cistrão, a necessária ausência de codões STOP dentro dos constructos, etc… Combinamos este exercício com o desenho de um par FRET para analisar as interações entre proteínas. Os estudantes produziram um sistema bicistronico FRET, no qual fusionaram duas proteínas de interesse (STAT3 e STAT1) com duas proteínas fluorescentes que eram um par FRET. Entre as duas proteínas de fusão meteram uma sequência autoclivável P2A, o que permitiria expressar as duas proteínas de fusão a partir do mesmo promotor e do mesmo plasmídeo. Os estudantes terminaram o trabalho em casa, e entregaram-o no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.

Medicina Personalizada no Cancro do Pulmão – EGFR, LAMP e Diagnóstico Point-of-Care

6 Maio 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

O objetivo principal desta aula foi familiarizar os estudantes com novas tecnologías que podiam servir para estudar mutações específicas que afetam proteinas sinalizadoras como o recetor EGFR.

1. Contextualização do Cancro do Pulmão e Importância Clínica

Iniciámos a aula destacando que o cancro do pulmão é a principal causa de morte oncológica a nível mundial, com 2,2 milhões de novos casos e 1,8 milhões de mortes anuais. Em Portugal, representa mais de 5.400 novos casos e 4.800 mortes por ano, sublinhando a necessidade de estratégias inovadoras para diagnóstico e tratamento.

2. Factores de Risco e Epidemiologia

Debatemos os principais factores de risco:

• Tabagismo como fator predominante, incluindo exposição passiva ao fumo.

• Radão, poluição, e outros tóxicos ambientais aumentam o risco.

• Os casos estão a crescer globalmente, prevendo-se um aumento de 60-70% em novos casos e mortes nas próximas décadas, mesmo em países de baixo e médio rendimento.

3. Tipos de Cancro do Pulmão

A aula detalhou as duas categorias principais:

• Cancro do pulmão de pequenas células (SCLC)

• Cancro do pulmão de não pequenas células (NSCLC), que inclui adenocarcinoma, carcinoma escamoso e carcinoma de grandes células.
  Destacámos que o NSCLC, em particular o adenocarcinoma, é o alvo da maioria das terapias personalizadas modernas.

4. Medicina Personalizada – O Papel das Mutações EGFR

Explicámos que as terapias convencionais (quimioterapia, radioterapia, cirurgia) são eficazes, mas têm elevada toxicidade.
Entrámos no domínio da medicina personalizada, focando:

• O papel das mutações no gene EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico) – presentes em muitos NSCLC e fundamentais para orientar terapias dirigidas.

• Mutações como L858R e deleção no exão 19 ativam permanentemente a via de sinalização, levando à proliferação descontrolada.

• Terapias alvo (ex.: Gefitinib) bloqueiam especificamente a atividade do EGFR mutado, aumentando taxas de resposta e sobrevida em doentes com mutação, mas não são eficazes em tumores sem essa mutação – conceito de “tratamento à medida do perfil molecular”.

5. Implementação Diagnóstica – Dispositivos Point-of-Need e LAMP

A transição para métodos rápidos e acessíveis abordada nesta aula é crítica:

• Técnicas tradicionais como PCR e NGS são exatas, mas caras, complexas e demoradas.

• A tecnologia LAMP (amplificação isotérmica mediada por “loop”) permite detetar rapidamente mutações a partir de sangue ou saliva – em menos de uma hora, no consultório (“point-of-care” ou “point-of-need”).

• Analisámos o workflow: recolha de sangue, extração de cfDNA, preparação da reação, inserção no dispositivo portátil Doctor Vida, e análise via app mobile.

• Vantagens: rapidez, portabilidade, baixo custo, menor necessidade de manipulação laboratorial e resistência a inibidores naturais das amostras.

6. Resultados Clínicos e Casos de Uso

Vimos exemplos concretos de diagnósticos:

• Testes LAMP mostraram alta sensibilidade e especificidade versus métodos clássicos, com precisão de mais de 95% para detetar mutações L858R e deleções do exão 19.

• Exemplos reais de resultados exibidos na app, com capacidade de distinguir genótipos em casos de intolerância à lactose e de cancro do pulmão.

7. Aplicabilidade e Perspectivas Futuras

Terminámos a aula a discutir o impacto destes métodos na prática médica:

• Mais doentes poderão beneficiar de terapias dirigidas e ajuste precoce do tratamento, sobretudo em contextos de recursos limitados ou sem acesso a laboratórios centrais.

• Utilização potencial em monitorização de resposta terapêutica e detecção precoce de recidiva tumoral.

• O “lab-on-phone” democratiza o acesso ao diagnóstico, aproximando a precisão molecular aos cuidados clínicos de rotina.

Optogenética para Compreender o Cérebro

5 Maio 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Professor convidado: Inês Ribeiro

Hoje explorámos o conceito, as ferramentas e as aplicações da optogenética, uma técnica revolucionária na neurobiologia que permite manipular a atividade de neurónios individuais com luz, em tempo real e com grande precisão.

1. Introdução e desafio científico

Começámos pela motivação: o comportamento animal (como fuga, alimentação, corte, agressividade) decorre da integração de estímulos sensoriais externos, estados internos e memória. O grande desafio é perceber, no meio da complexidade cerebral, que neurónios concretizam que papel em cada circuito comportamental.

2. Métodos clássicos versus genéticos

Discutimos como, até há pouco tempo, as técnicas para manipulação neuronal eram pouco específicas — ablação, fármacos, estimulação elétrica — afetando populações mistas e sem controlo temporal ou espacial fino.
Agora, com ferramentas genéticas, tornou-se possível aceder e manipular tipos neuronais individuais:

• Linhas GAL4 permitem direcionar a expressão de transgenes apenas em determinados neurónios, ativando, silenciando ou monitorizando a sua atividade.

3. Manipulação da atividade neuronal

Expliquei os métodos para ativar ou silenciar neurónios:

• Silenciamento: tetanus toxin (bloqueia libertação de neurotransmissor) ou canais de potássio Kir2.1 (hiperpolarizam membrana).

• Ativação: canais de sódio bacterianos (ex.: NachBac) promovem despolarização.

• Estas manipulações genéticas podem ser revertidas ou alternadas nos próprios animais, oferecendo controlo experimental “intra-indivíduo”.

4. Optogenética: controlo pela luz

Apresentei o conceito-chave da aula:

• Expressando proteínas sensíveis à luz (por exemplo, channelrhodopsinas de algas ou CsChrimson de algas vermelhas) em neurónios específicos, podemos usar flashes de luz para ativar ou silenciar exatamente esses neurónios — e só esses!

• Demonstrei exemplos experimentais em mosca-da-fruta (Drosophila), onde a ativação unilateral de um grupo de neurónios visuais (LC10a) leva a comportamentos específicos, como virar para o lado iluminado.

5. Ferramentas optogenéticas avançadas

Discutimos variedades de canais sensíveis a diferentes comprimentos de onda (luz vermelha, azul), combinando proteínas de diferentes espécies.

• O uso de sistemas como LOV-LexA (baseado em domínio LOV2 da fototropina de plantas) permite ainda maior controlo — ativando a expressão de genes apenas em resposta a luz azul, por exemplo.

• O controlo espácio-temporal da expressão e função neuronal torna possível testar hipóteses com uma precisão até há pouco tempo impensável.

6. Exemplo prático: comportamento sexual e circuitos neuronais

Explorámos um caso real estudando a orientação e perseguição durante o cortejo na Drosophila:

• Acesso genético a neurónios “projecção visuais” permite manipular seletivamente circuitos implicados na identificação e perseguição do parceiro.

• Ferramentas optogenéticas demonstram que até um pequeno número de neurónios LC10a ativados pode alterar o comportamento reprodutivo e orientar movimentos específicos.

7. Conclusões e aplicações

Finalizámos por sublinhar o impacto da optogenética:

• Estas técnicas permitem atribuir funções precisas a tipos neuronais, redes e sinapses concretas, ligando padrões de atividade neuronal ao comportamento e até à patologia.

• O controlo dinâmico e reversível da atividade cerebral por luz abre portas a investigações em toda a neurociência — do comportamento aos circuitos cerebrais e possíveis aplicações biomédicas e terapêuticas.