Sumários

Transdução III – A Via de PI3K/Akt (PKB)

8 Abril 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, explorimos uma das rotas mais centrais e flexíveis da sinalização celular: a via dos fosfoinositídeos (PI3K/Akt). Esta cascata é fundamental para o controlo do crescimento, sobrevivência, metabolismo e motilidade celular, e está fortemente implicada em cancro e várias patologias.

1. Fosfoinositídeos e enzimas envolvidas

Começámos por rever a família dos fosfoinositídeos, lípidos minoritários da membrana que, apesar da baixa abundância, são potentes reguladores espaciais de tráfego e sinalização intracelular.
Discutimos as várias cinases e fosfatases (como PI4-quinase, PIP5-quinase, PI3K e PTEN) responsáveis pela fosforilação/desfosforilação dos anéis de inositol em diferentes posições, gerando uma diversidade de moléculas-sinal (PIP, PIP2, PIP3...).

2. Dinâmica nas membranas celulares

Expliquei que os fosfoinositídeos criam plataformas bioquímicas específicas onde recrutam proteínas contendo domínios PX, PH, FYVE, entre outros.
Estes domínios direccionam a localização das proteínas, ativam-nas alostericamente e regulam o tráfego e composição das membranas internas.

3. Mecanismo de ativação da via PI3K/Akt

A sinalização inicia-se tipicamente via recetores tirosina-quinase (RTKs) ativados por fatores de crescimento (ex.: PDGF, IGF-1). O RTK recrutam e ativam PI3K, que converte PIP2 em PIP3 na membrana.
O aumento de PIP3 serve de docking para proteínas adaptadoras e para a Akt (PKB) e PDK1, ativando-as sequencialmente na membrana.
Discussámos o papel do Ras-GTP como “ponte” e amplificador do sinal, integrando a ativação de PI3K com outras cascatas (MAPK).

4. Regulação e papel do PTEN

Destacámos o papel de PTEN, uma fosfatase-lipídica e onco-supressor, que degrada PIP3 de volta a PIP2, interrompendo o sinal e atuando como travão contra a proliferação descontrolada.
A perda ou mutação de PTEN está associada com diversos tipos de tumor, devido à hiperativação sobre a via PI3K/Akt.

5. Funções da Akt (PKB) e integração de sinais

A Akt é uma quinase central que regula:
- Sobrevivência celular (via inibição de apoptose, ex.: fosforilação do BAD),
- Proliferação e crescimento (via ativação de mTOR, aumento de síntese proteica),
- Metabolismo (via múltiplos alvos: FOXO, GSK3, enzimas metabólicas).
Mostrámos como Akt pode inibir fatores de transcrição pró-apoptóticos (FOXO), promover a síntese de glicogénio, e modular o metabolismo.

6. Ramificações, feedback e cross-talk

Falámos sobre ramificações que envolvem o mTORC1/2 (controlo do crescimento, mobilidade e metabolismo), integração com vias MAPK, regulação do citoesqueleto e tradução protéica.
Dei exemplos de feedback negativo (pelo S6K, afetando IRS-1), explicando como a célula ajusta a intensidade e duração do sinal.

7. Relevância biomédica e clínica

Destacámos como a via PI3K/Akt é alvo terapêutico em oncologia, doenças metabólicas e neurodegeneração, graças à sua centralidade no controlo do crescimento, sobrevivência e metabolismo celular.
Discutimos como abordagens de proteómica (“MudPIT”) podem mapear a fosforilação de proteínas-alvo durante a ativação da via.

Transdução II – Cascatas de Cinases

7 Abril 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, aprofundámos o estudo das vias de sinalização celular mediadas por recetores ligados a enzimas, com ênfase especial nas cascatas de cinases, fundamentais para a resposta a estímulos extracelulares.

1. Classes principais de recetores ligados a enzimas

Discutimos as três famílias principais:
- Recetores tirosina-quinase (RTKs): como o receptor de EGF e de PDGF, que autossuficientemente fosforilam resíduos de tirosina.
- Recetores tirosina-quinase associados: recetores que recrutam cinases citosólicas, como acontece com o sistema das citocinas (JAK-STAT).
- Recetores serina/treonina-quinase: por exemplo, os recetores TGF-β que ativam a via Smad.

2. Mecanismo de ativação e propagação do sinal

Após ligação do sinal (exemplo: factor de crescimento), os recetores dimerizam e sofrem autofosforilação em resíduos específicos de tirosina.
A fosforilação cria pontos de ancoragem para proteínas adaptadoras ou efetoras, que reconhecem estes resíduos fosforilados através de domínios SH2 e PTB (funcionando como “tomadas de fichas” para transmitir a eletricidade – neste caso, o sinal!).
A especificidade da propagação depende da sequência adjacente à tirosina fosforilada, permitindo a ligação de diferentes proteínas efetoras e, consequentemente, diferentes respostas celulares.

3. A cascata do Ras e proteínas adaptadoras

Focámos a rede de proteína adaptadoras (exemplo: Grb2 com domínios SH2 e SH3), que ligam os RTKs à proteína GTPase Ras, por meio da GEF Sos.
A Ras, quando ativada por GTP, serve de chave para acionar múltiplas vias – em destaque a cascata MAPK (Raf → MEK → ERK), amplificando o sinal através de fosforilações em cadeia.
Discutimos outras pequenas GTPases (Rab, Rho, Ran) envolvidas em motilidade, transporte vesicular e organização do citoesqueleto.

4. Modularidade e integração dos sinais

Chamámos a atenção para a importância dos domínios modulares SH2, PTB e SH3 na construção de rotas de sinalização, permitindo a integração (“cross-talk”) entre diferentes vias e resposta coordenada a múltiplos estímulos.
Demonstrámos, por exemplo, como a mesma cascata ERK pode ser ativada por diferentes recetores e, consoante a intensidade/duração do estímulo, levar à proliferação, diferenciação ou migração celular.

5. Regulação da resposta e terminação do sinal

Explicámos os mecanismos de dessensibilização: ubiquitinação, endocitose, degradação dos recetores ativados e desfosforilação por fosfatases.
Substituir ou reciclar os recetores é essencial para ajustar a sensibilidade da célula a novos estímulos e evitar respostas patológicas.
Destacámos as consequências patológicas de alterações nestas vias, em especial mutações em Ras (implicadas em cancro) e desregulação da via MAPK.

6. Aplicações e exemplos biomédicos

Abordámos exemplos como o papel das vias JAK-STAT na hematopoiese e imunidade, assim como a participação das cascatas MAPK no crescimento e sobrevivência celular, sendo alvos principais no desenvolvimento de terapias anticancerígenas.

TP2: Mutagénese dirigida para mimetizar ou bloqueiar modificações pos-traducionais

2 Abril 2025, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Na segunda TP de sinalização celular, os estudantes aprenderam os procedimentos para realizar uma mutagénese dirigida num plasmídeo, por médio de PCR. Aprenderam a desenhar primers de mutagénese com um programam online (PrimerX), e desenharam primers para mutar diversos resíduos da proteína STAT3 que podiam ser modificados pós-traducionalmente. Aprendimos a fazer modificações que mimetizam fosforilação ou acetilação ou que bloqueiam estas modificações sem mudar demasiado a estrutura da proteína. Este trabalho foi entregue no Moodle e os estudantes receberam feedback da qualidade dos primers. Este foi também um ponto de avaliação para as TPs.

TP2: Mutagénese dirigida para mimetizar ou bloqueiar modificações pos-traducionais

1 Abril 2025, 15:30 • Federico Herrera Garcia

Transdução I – GPCRs

1 Abril 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, explorámos os recetores acoplados à proteína G (GPCRs), uma das maiores e mais versáteis famílias de recetores celulares, fundamentais para a perceção do meio e transdução do sinal nas células.

1. Fundamentos dos GPCRs

Os GPCRs têm uma estrutura com 7 hélices transmembrana que atravessam a membrana plasmática, e apresentam regiões extracelulares para ligação ao ligando e citoplasmáticas para interagir com proteínas G heterotriméricas.
A diversidade nas regiões de ligação à proteína G explica a especificidade na ativação dos vários subtipos de proteínas G.

2. Ativação das proteínas G heterotriméricas

A ligação do ligando ao GPCR provoca uma alteração conformacional que atua como fator de troca de nucleótido de guanina (GEF) para a proteína G: promove a troca de GDP por GTP na subunidade α, ativando a proteína G.
As subunidades α-GTP e βγ dissociam-se, interagindo com diferentes efetores intracelulares para propagar o sinal.
A hidrólise do GTP para GDP na subunidade α (ativada por proteínas GAP) termina o sinal, permitindo que as subunidades se reúnam no estado basal.

3. Tipos de proteínas G e seus efeitos

As principais famílias são:
- Gs (ativa adenilil ciclase, aumenta cAMP)
- Gi (inibe adenilil ciclase, regula canais iónicos)
- Gq (ativa fosfolipase C ß, gerando DAG e IP3, aumentando o Ca²⁺ intracelular)
- G12/13 (ativa pequenas GTPases Rho, regulando o citoesqueleto)
Cada uma destas proteínas está associada a recetores específicos, que respondem a vários tipos de ligandos tais como neurotransmissores, hormonas, lipídios, peptídeos e até estímulos sensoriais (luz e odorantes).

4. Via dos segundos mensageiros

A ativação de adenilil ciclase por Gs promove a síntese de AMP cíclico (cAMP), um mensageiro que ativa a proteína quinase A (PKA) e modula diversas funções celulares, incluindo metabolismo, expressão génica e mobilização celular.
O Gq ativa a fosfolipase C-ß que hidrolisa PIP2 em IP3 e DAG. IP3 promove a libertação de Ca²⁺ do retículo endoplasmático e DAG ativa a proteína quinase C (PKC), ambos mediados na amplificação do sinal.

5. Regulação e dessensibilização dos GPCRs

Após ativação, mecanismos como a fosforilação pelo kinase das proteínas G (GRKs), recrutamento da β-arrestina e clatrina, levam à inativação e internalização dos recetores, controlando a resposta e limitando a duração do sinal.
Estas etapas também permitem o recíproco cruzado e a interação com outras vias de sinalização celular.

6. Papéis fisiológicos dos GPCRs

GPCRs estão implicados na regulação do sistema imunitário (mediadores inflamatórios e quimiocinas), na modulação do metabolismo celular, crescimento, motilidade e na função do sistema nervoso (neurotransmissores como serotonina, dopamina, GABA).
A via dos peptídeos natriuréticos e da guanilil ciclase também foi comentada, destacando a importância da regulação cardiovascular e homeostasia de fluidos via segundos mensageiros cGMP.

7. Exemplos clínicos e patológicos

Como exemplo, discutimos a toxina da cólera que modifica covalentemente a subunidade Gs, bloqueando a sua inativação e causando um aumento prolongado do cAMP, resultando em diarreia grave.
Além disso, a diversidade de GPCRs e suas vias significa que são alvos fundamentais para a terapêutica medicamentosa em várias doenças, incluindo o cancro, doenças cardiovasculares, inflamação e neurodegeneração.