Sumários

Modificações Pós-Traducionais (PTMs) na Regulação Bioquímica

31 Março 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Esta clase explora de forma detalhada a contribuição das modificações pós-traducionais das proteínas para a complexidade, regulação e coordenação das funções celulares.

Complexidade do proteoma:
- O número de proteínas geradas numa célula resulta de combinações entre genes, splicing alternativo, diferentes promotores, edição de mRNA, interações proteína-proteína e, acima de tudo, modificações pós-traducionais.
- Estima-se que existam mais de um milhão de proteoformas humanas resultantes destas combinações.
Principais tipos de modificações pós-traducionais:
- Adições covalentes que podem alterar atividade, localização, interação e estabilidade das proteínas.
- Mais de 200 tipos conhecidos e presentes em mais de 80% das proteínas eucarióticas.
- Exemplos mais comuns:
  - Fosforilação: Adição reversível de grupos fosfato por cinases (Ser, Thr, Tyr), regulando a ativação, localização e interação de proteínas em vias de sinalização.
  - Glicosilação: Adição enzimática de monossacarídeos, necessária para o correto funcionamento de muitas proteínas, distinguindo-se da glicação (não enzimática).
  - Acetilação: Adição de grupos acetilo geralmente na extremidade N-terminal ou em lisinas, influenciando a expressão génica (ativação de cromatina via acetilação de histonas) e estabilidade de proteínas.
  - Metilação: Adição de grupos metilo, tipicamente em histonas, com impacto no estado da cromatina (condensação/silenciamento vs relaxamento/atividade).
  - Ubiquitinação/SUMOilação: Ligação de moléculas de ubiquitina (ou SUMO) a lisinas, regulando a degradação proteica, tráfego, localização e sinalização.
  - Clivagem proteolítica: Ativação de pré-proteínas (como proinsulina/insulina) e envolvimento em processos de apoptose (caspases), processamento proteico normal ou patológico (exemplo: proteínas amilóides).
  - Outras: sulfatacão, acetilação, hidroxilação, adp-ribosilação, entre dezenas de outras.
Regulação por degradação proteica:
- Degradação em lisossoma (autofagia, endocitose) ou proteassoma (dependente de ubiquitina) garante recambio e controlo de proteínas-chave.
- O sistema ubiquitina-proteassoma reconhece sequências específicas (degrões) e depende do resíduo N-terminal das proteínas para determinar a estabilidade.
- Mecanismos como a via N-terminal e via dos degrões internos são exemplos de como a célula regula a meia-vida das proteínas.
Exemplos fisiológicos e biomédicos:
- Regulação de fatores de transcrição e resposta ao stress (ex: HIF na hipóxia, Nrf2 em stress oxidativo), sinalização imune (NF-kB/IκB via ubiquitinação), sinalização hormonal e controle celular.
- PTMs são alvo de avanços terapêuticos, como fármacos PROTACs que aceleram a degradação seletiva de proteínas patogénicas.
Cronologia e avanços:
- O documento destaca a evolução histórica da descoberta das vias de degradação de proteínas, desde o lisossoma ao sistema ubiquitina-proteassoma, e as estratégias terapêuticas inovadoras.

TP1: Construção de uma proteína de fusão num plasmídeo de expressão em mamíferos

26 Março 2025, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Nesta primeira TP da sinalização celular, os estudantes aprofundaram no trabalho com sequências de DNA, utilizando o programa de acesso livre A Plasmid Editor. Os estudantes exploraram o mapa e a sequência do plasmídeo de expressão em mamíferos pcDNA 3.1-. Identificaram os elementos mais relevantes de um plasmídeo e a sua função, incluído o local de clonagem múltipla. Aprenderam a marcar características na sequência, a identificar locais de enzimas de restrição, a representar o plasmídeo de diferentes formas, a traduzir sequências de DNA a aminoácidos, etc… Expliquei os procedimentos de clonagem com enzimas de restrição, e as chaves para criar quimeras ou proteínas de fusão com uma proteína de interesse e uma tag qualquer (neste caso fluorescente). Expliquei como encontrar sequências consenso dos nossos genes de interesse online (CCDS report, pubmed, uniprot), e também como encontrar as sequências e propriedades específicas de proteínas fluorescentes (FPbase). Os estudantes fizeram um constructo no qual meteram no local de clonagem múltipla (MCS) do vetor pcDNA3.1- uma proteína de interesse fusionada com mCherry. Este trabalho foi entregue no Moodle e os estudantes receberam feedback da qualidade dos constructos.

TP1: Construção de uma proteína de fusão num plasmídeo de expressão em mamíferos

25 Março 2025, 15:30 • Federico Herrera Garcia

Barreira Energética: Regulação Termodinâmica e Fluxo nas Vias Metabólicas

25 Março 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula aborda o papel da barreira energética (ou termodinâmica) na regulação bioquímica, destacando a relação entre design metabólico, acoplamento de reações e decisão do sentido e eficiência do metabolismo celular.

Componentes de regulação: Além das barreiras de permeabilidade (troca de matérias) e cinética (velocidade das reações), existe a barreira energética, ligada à tendência natural de uma reação ocorrer, expressa pela variação da energia livre de Gibbs (ΔG).
Relação entre cinética e termodinâmica:
- ΔG determina se uma reação é espontânea, mas não a sua velocidade.
- A cinética depende da energia de ativação e dos catalisadores, enquanto a termodinâmica dita a posição de equilíbrio.
Exemplo da glicólise: Tabela de reações glicolíticas mostra que algumas etapas são fortemente exergónicas (ΔG muito negativo), assegurando direção e irreversibilidade, enquanto outras estão próximas do equilíbrio.
- Vias diferentes (EMP/ED) em procariontes exemplificam variações de rendimento energético e “distância” ao equilíbrio (mais longe = mais dissipação energética).
Compensação entre rendimento, velocidade e custo proteico:
- Células ajustam o metabolismo consoante o contexto. Podem optar por caminhos menos eficientes em ATP, mas mais rápidos (efeito de Warburg em células cancerígenas e ativação de células T), compensando entre velocidade de geração de energia e investimento proteico.
Acoplamento de reações:
- Reações desfavoráveis (ΔG positivo) avançam por acoplamento a reações fortemente favoráveis, como a hidrólise de ATP.
- O acoplamento permite direcionar o fluxo metabólico para a síntese de moléculas complexas e manutenção da homeostase.
Transportadores de grupos ativados:
- ATP, coenzimas fosfatadas/aciladas e nucleotídeos reduzem transferem energia entre reações, e controlam o fluxo.
- Apesar da espontaneidade das hidrólises de ATP ou NADH/FADH2, são as enzimas que realmente controlam o ritmo e aproveitamento energético.
Carga energética:
- A percentagem de ATP, ADP e AMP define a carga energética da célula, que se mantém próxima de 0,9.
- Quando a carga desce, predominam reações catabólicas; quando sobe, predominam as anabólicas.
- A carga energética é mantida por sistemas tampão, ajustando o metabolismo conforme necessidade.
Medida de metabolismo in vivo:
- A taxa de dissipação energética, medida por calorimetria, é biomarcador de estados metabólicos ou de deficiência nutricional.
Teoria da demanda em biologia:
- Analogia com economia, onde a célula ajusta a expressão e atividade de genes e vias em resposta a necessidade (procura), equilibrando produção, consumo e adaptação fisiológica.
- Mecanismos regulatórios, como ativadores/repressores, e feedback, funcionam como “mecanismos de preço”.
Aviso:
- A analogia com economia serve apenas como orientação conceptual — os mecanismos moleculares têm regras e respostas próprias, distintas das forças de mercado.

Controlo Metabólico Moderno: Análise Quantitativa e Distribuição do Controlo

24 Março 2025, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula aborda o conceito moderno de controlo metabólico, que substitui a ideia clássica de um "passo limitante" único pela noção de controlo distribuído por várias enzimas e etapas das vias metabólicas.

Controlo distribuído: Já não se considera que existe apenas um passo limitante num percurso metabólico; o controlo do fluxo global está, na verdade, repartido por diferentes reações. A intensidade do controlo é quantitativamente expressa por coeficientes de controlo.
Definições chave:
- Controlo refere-se à capacidade de alterar, aumentar, diminuir ou redirecionar o fluxo de uma via metabólica em resposta a sinais externos.
- Regulação inclui todos os processos que mantêm a função ou adaptam o sistema a novas condições.
Coeficientes de controlo metabólico:
- Coeficiente de controlo do fluxo indica quanto a alteração relativa da atividade de uma enzima afeta o fluxo global de uma via. Matemáticamente, este coeficiente mede a variação percentual do fluxo quando a concentração ou atividade da enzima é alterada percentualmente.
- Coeficiente de controlo de concentração indica como a variação na atividade de uma enzima afeta a concentração de um metabolito específico.
- Coeficiente de elasticidade é uma propriedade local e descreve a sensibilidade da velocidade de uma reação a alterações nas concentrações de substrato, produto ou inibidor.
Teoremas fundamentais:
- Teorema da soma dos coeficientes de controlo de fluxo: A soma dos coeficientes de controlo do fluxo de todas as enzimas de uma via é igual a 1.
- Teorema da soma dos coeficientes de controlo de concentração: A soma destes coeficientes em relação a um metabolito resulta em 0.
Aplicação prática:
- O controlo do metabolismo não se encontra concentrado, mas é uma propriedade emergente do sistema, podendo mesmo pequenas alterações em diferentes enzimas ou transportadores ter impacto significativo.
- O documento discute métodos experimentais para determinar os coeficientes de controlo, como manipulação genética, titulação enzimática e modelação numérica.
- A análise quantitativa permite identificar quais passos são mais eficazes para manipular o fluxo metabólico, importante tanto em biotecnologia como em terapias farmacológicas.
Exemplo:
- Numa via linear, quando uma reação é irreversível, os passos subsequentes não exercem controlo sobre o fluxo total. Em situações reais, o controlo é sempre partilhado e pode ser reconfigurado por feedback negativo, adaptação e outros mecanismos.
Importância:
- A análise de controlo metabólico modera o conceito de "enzima-chave", mostrando que a resposta do sistema é integrada, dinâmica e sensível a múltiplos pontos de regulação.