Sumários

Aula 16

28 Abril 2022, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Gastrulação e a formação do eixo antero-posterior e polarização dorso-ventral em embriões de mamíferos Diferênças entre o modelo anfíbio e a ave/mamífero no que respeita a indução neural. O papel do hipoblasto primário e secundário na indução neural vs indução da gastrulação e o papel da “anterior visceral endoderm” nos embriões de mamíferos.

O desenvolvimento de assimetria esquerda-direita, focando principalmente no modelo de ratinho O primeiro órgão a tornar-se assimétrico durante o desenvolvimento é o coração.

Quais as evidências genéticas de assimetría esquerda-direita? Expressão assimétrica de e.g. Nodal, Pitx2, Snail, Caronte na mesoderme lateral. Sobreexpressão do Nodal do lado direito causa randomização no torcimento do coração. A assimetría esquerda direita surge muito cedo. Estádio HH5 na galinha há expressão assimétrica de Nodal, Shh, Fgf8, Delta a volta do nó de Hensen. Assim, a assimetria esquerda-direta estabelece-se em fases: 1. A volta do nó; 2. Na mesoderme lateral; 3. Assimetria morfológica dos orgãos internos.

A descoberta dos monocílios do nó no embrião de ratinho. Experiêncas do Takeda et al 1999. A hipotese do fluxo nodal. A secreção contendo morfogénios como indutores de assimetria.

Desenvolvimento dos restantes órgãos internos derivados da endoderme e mesoderme esplâncnica.

Aula 4

26 Abril 2022, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Processamento dos embriões de galinha recolhidos e fixados na aula anterior para coloração nuclear e a subsequente observação e aquisição de imagem em lupa ou microscópio de fluorescência (sala 2.1.15). Esta aula contou com o apoio do Luís Marques, técnico de microscopia.

Protocolo da aula:

COLORAÇÃO NUCLEAR DE EMBRIÕES DE GALINHA (2-3 dias) E A SUA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

1. Calçar luvas e colocar os tubos com embriões de galinha da aula anterior num suporte para tubos.

2. Na HOTTE, retirar o fixador (4% PFA em PBS; tóxico) dos tubos utilizando uma pipeta Pasteur com ponta fina (marcada LIXO) e despejar o fixador no contentor do líxo tóxico líquido.

3. Encher o tubo até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

4. Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar com agitação outros 10 min. Repetir uma terceira vez.

5. Depois da terceira lavagem colocar os embriões numa caixa de Petri com PBS e retirar o máximo das membranas extraembrionárias usando piças e a tesoura. Voltar a pôr os embriões no tubo com PBS.

6. Na HOTTE e usando uma micropipeta, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBS; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 2 min.

7. Na HOTTE retirar o DAPI com a micropipeta e colocar no tubo marcado “Lixo DAPI”. Encher os tubos com os embriões até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

8. Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar outros 10 min.

9. Preparar uma caixa de Petri por grupo com 1% bactoagar em água a cobrir o fundo. Transferir os melhores embriões de cada estádio para esta caixa e, com as pinças, orientá-los da melhor maneira para a posterior captação de imagens. Retirar o excesso de PBS para que os embriões fiquem pousados em cima do agar. Escrever no lado da caixa o estádios HH dos embriões na caixa e indicar os vossos nomes/turma. No caderno, fazer um desenho da caixa indicando a posição e o estádio HH de cada embrião. Se tiverem muitos embriões bons, podem preparar uma segunda caixa.

10. Levar a caixa de Petri com os embriões para a Unidade de Microscopia (sala 2.1.15; https://fculmf.campus.ciencias.ulisboa.pt/) e observa-los utilizando a lupa de fluorescência (LUMAR) ou os microscópios de fluorescência (BX60 ou BX61). Faz aquisição de imagens com ajuda do técnico, Luís Marques.

Material: Luvas, PBS (Phosphate Buffered Saline), 5 µg/ml DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol; tóxico), em PBS, pipetas de Pasteur de ponta fina, pipetas de Pasteur standard, micropipetas e pontas, lupa com iluminador, pinças (grossa/fina), tesoura fina, caixas de Petri, 1% bactoagar em água.

Aula 4

26 Abril 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Protocolo da aula:

COLORAÇÃO NUCLEAR DE EMBRIÕES DE GALINHA (2-3 dias) E A SUA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

1. Calçar luvas e colocar os tubos com embriões de galinha da aula anterior num suporte para tubos.

2. Na HOTTE, retirar o fixador (4% PFA em PBS; tóxico) dos tubos utilizando uma pipeta Pasteur com ponta fina (marcada LIXO) e despejar o fixador no contentor do líxo tóxico líquido.

3. Encher o tubo até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

6. Na HOTTE e usando uma micropipeta, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBS; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 2 min.

7. Na HOTTE retirar o DAPI com a micropipeta e colocar no tubo marcado “Lixo DAPI”. Encher os tubos com os embriões até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

Not Taught.

26 Abril 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aula 15

21 Abril 2022, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Gastrulação e a formação do eixo antero-posterior e polarização dorso-ventral em embriões de peixes e aves. Homologias com os embriões de anfíbio no que respeita aos mecanismos moleculares na indução do Centro de Nieuwkoop e o Organizador. O papel importante do hipoblasto primário e secundário nas aves.