Aula 20

12 Maio 2022, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Continuação da aula anterior sobre a formação dos segmentos nos embriões de vertebrados.. A ativação do Mesp2/Meso1 e a definição do local da fenda. A indução de EphA4 pelo Mesp2/Meso1 produz a fenda. O papel da matriz de fibronectin na epitelização dos sómitos e como estabilizador da fenda.

Os diferentes derivados dos sómitos. A polarização dorso-ventral e medio-lateral dos sómitos é mediada por factores parácrinos segregados pelos tecidos adjacentes. Experiências que mostraram que a notocorda induz a formação do esclerótomo e que o factor responsável é o sonic hedgehog. A iniciação da miogénese – o papel de sinalização notch induzida pela crista neural durante a passagem pelos sómitos. Os Wnts são essenciais para a manutenção do dermomiótomo e para a indução da miogénese tanto medianamente (Wnt1 e Wnt3a) como lateralmente (Wnt7a). Notem a analogia com a Drosophila onde o hedgehog e o wingless polarizam os segmentos. A indução do sindetome pelo Fgf8 do miótomo. A resegmentação do esclerótomo.

Aula 5

10 Maio 2022, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Processamento das imagens adquiridas na aula anterior. Construção de mosaicos, colocação de escalas e medição do eixo maior dos embriões dos diferentes estádios. Elaboração de um relatório com os resultados obtidos. Esta aula contou com o apoio do Luís Marques, técnico de microscopia.

Protocolo da aula:

ANÁLISE DAS IMAGENS DE EMBRIÕES DE GALINHA E AS SUAS MEDIÇÕES EM FIJI

Instalar Fiji:

1. descarregar o zip da pagina www.fiji.sc

2. criar a pasta C:\Fiji no Windows

3. descarregar o conteúdo do zip para essa pasta, deverão ficar com "C:\Fiji\fiji.app"

4. abrir o executável dentro dessa pasta, fazer as atualizações pedidas, e reiniciar se necessário

Montar mosaicos:

(apenas para BX60 e BX51)

1. em cada pasta que contem os ficheiros de "azulejos" (geralmente "Default"), remover o ficheiro "metadata.txt" - podem cortar e cortar para a pasta hierarquicamente acima.

2. abrir um dos ficheiros no Fiji (basta arrastar), ir a Image > Properties, e apontar os valores de "Pixel width / height" em micrómetros

3. Na barra do Fiji "Click here to search", procurar por "Grid/Collection Stitching", e abrir ("Run") esse plugin

4. Escolher "Type: Unknown Position", "OK".

5. Localizar para a pasta em actividade desde o ponto (1.).

Manter todos os settings, e único "check" deverá ser em "Display Fusion". "OK", e aguardar.

6. Na imagem computada, ir a Image > Properties, e repor os valores de "Pixel width / height" em micrómetros descobertos no ponto (2.)

7. Adicionar uma barra de escala de tamanho conveniente em Analyze > Tools > Scale Bar

8. Guardar como *.tiff

Medições eixo maior:

1. Abrir imagem mosaico computada no Fiji.

2. Clicar no ícone de selecção/linha com o botão direito e escolher "Segmented line".

3. Traçar um segmento quebrado reproduzindo fielmente a curva do embrião, duplo clique para terminar.

4. Duplo clique no ícone de linha para ajustar uma "spline" à linha, e aumentar a sua espessura.

Opção:

4.1. Medir a linha multi-segmentada directamente em "Analyze > Measure", apontar o valor para o Excel

OU

4.2. Ajustar a espessura da linha para compreender todo o embrião, e ir a "Edit > Selection > Straighten". Traçar uma linha perfeitamente rectilínea e medir essa linha em "Analyze > Measure". Apontar esse valor no Excel.

Dados:

1. Recolher medições do eixo maior do maior número possível de estágios e criar um gráfico de crescimento

2. Criar uma “plate” com um conjunto de imagens representativas dos diferentes estádios, idealmente à mesma escala

(dica: usar sempre a mesma escala nos mosaicos, inseri-los no Powerpoint, e ajustar os tamanhos relativos de todas as imagens de modo a que as BARRAS de escala tenham todas visualmente o mesmo tamanho)

Anotar convenientemente cada imagem, por exemplo apontando estruturas comuns na sequência (ver ficheiro “Formato_relatorio2_imagens_galinha.pdf”).

Material: Computadores portáteis, ratos, Fiji.

Aula 5

10 Maio 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Processamento das imagens adquiridas na aula anterior. Construção de mosaicos, colocação de escalas e medição do eixo maior dos embriões dos diferentes estádios. Elaboração de um relatório com os resultados obtidos. Esta aula contou com o apoio do Luís Marques, técnico de microscopia.

Protocolo da aula:

ANÁLISE DAS IMAGENS DE EMBRIÕES DE GALINHA E AS SUAS MEDIÇÕES EM FIJI

Instalar Fiji:

1. descarregar o zip da pagina www.fiji.sc

2. criar a pasta C:\Fiji no Windows

3. descarregar o conteúdo do zip para essa pasta, deverão ficar com "C:\Fiji\fiji.app"

4. abrir o executável dentro dessa pasta, fazer as atualizações pedidas, e reiniciar se necessário

Montar mosaicos:

(apenas para BX60 e BX51)

1. em cada pasta que contem os ficheiros de "azulejos" (geralmente "Default"), remover o ficheiro "metadata.txt" - podem cortar e cortar para a pasta hierarquicamente acima.

2. abrir um dos ficheiros no Fiji (basta arrastar), ir a Image > Properties, e apontar os valores de "Pixel width / height" em micrómetros

3. Na barra do Fiji "Click here to search", procurar por "Grid/Collection Stitching", e abrir ("Run") esse plugin

4. Escolher "Type: Unknown Position", "OK".

5. Localizar para a pasta em actividade desde o ponto (1.).

Manter todos os settings, e único "check" deverá ser em "Display Fusion". "OK", e aguardar.

6. Na imagem computada, ir a Image > Properties, e repor os valores de "Pixel width / height" em micrómetros descobertos no ponto (2.)

7. Adicionar uma barra de escala de tamanho conveniente em Analyze > Tools > Scale Bar

8. Guardar como *.tiff

Medições eixo maior:

1. Abrir imagem mosaico computada no Fiji.

2. Clicar no ícone de selecção/linha com o botão direito e escolher "Segmented line".

3. Traçar um segmento quebrado reproduzindo fielmente a curva do embrião, duplo clique para terminar.

4. Duplo clique no ícone de linha para ajustar uma "spline" à linha, e aumentar a sua espessura.

Opção:

4.1. Medir a linha multi-segmentada directamente em "Analyze > Measure", apontar o valor para o Excel

OU

4.2. Ajustar a espessura da linha para compreender todo o embrião, e ir a "Edit > Selection > Straighten". Traçar uma linha perfeitamente rectilínea e medir essa linha em "Analyze > Measure". Apontar esse valor no Excel.

Dados:

1. Recolher medições do eixo maior do maior número possível de estágios e criar um gráfico de crescimento

2. Criar uma “plate” com um conjunto de imagens representativas dos diferentes estádios, idealmente à mesma escala

(dica: usar sempre a mesma escala nos mosaicos, inseri-los no Powerpoint, e ajustar os tamanhos relativos de todas as imagens de modo a que as BARRAS de escala tenham todas visualmente o mesmo tamanho)

Anotar convenientemente cada imagem, por exemplo apontando estruturas comuns na sequência (ver ficheiro “Formato_relatorio2_imagens_galinha.pdf”).

Material: Computadores portáteis, ratos, Fiji.

Not Taught.

10 Maio 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aula 19

9 Maio 2022, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A formação dos segmentos nos embriões de vertebrados. Derivados destes segmentos e como contribuem para o plano corporal. A formação dos segmentos mesodérmicos através da somitogénese. A natureza temporal da somitogénese. O modelo “clock and wavefront”. O relógio molecular da somitogénese. As experiências da Isabel Palmeirim. A a sinalização notch como output do relógio molecular. As vias Wnt e Fgf como participantes nesse output. O possível papel do Fgf8 e Wnt3a na manutenção das oscilações de expressão dos genes do relógio. O Fgf8 como um gradiente de degradação de mRNA. A frente de determinação e a entrada num ambiente sem Fgf8 (wavefront) prepara as células para a somitogénese.