Not Taught.

12 Abril 2022, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Not Taught.

12 Abril 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aula 4

12 Abril 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Processamento dos embriões de galinha recolhidos e fixados na aula anterior para coloração nuclear e a subsequente observação e aquisição de imagem em lupa ou microscópio de fluorescência (sala 2.1.15). Esta aula contou com o apoio do Luís Marques, técnico de microscopia.

Protocolo da aula:

COLORAÇÃO NUCLEAR DE EMBRIÕES DE GALINHA (2-3 dias) E A SUA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

1.       Calçar luvas e colocar os tubos com embriões de galinha da aula anterior num suporte para tubos.

2.       Na HOTTE, retirar o fixador (4% PFA em PBS; tóxico) dos tubos utilizando uma pipeta Pasteur com ponta fina (marcada LIXO) e despejar o fixador no contentor do líxo tóxico líquido.

3.       Encher o tubo até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

4.       Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar com agitação outros 10 min. Repetir uma terceira vez.

5.       Depois da terceira lavagem colocar os embriões numa caixa de Petri com PBS e retirar o máximo das membranas extraembrionárias usando piças e a tesoura. Voltar a pôr os embriões no tubo com PBS.

6.       Na HOTTE e usando uma micropipeta, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBS; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 2 min.

7.       Na HOTTE retirar o DAPI com a micropipeta e colocar no tubo marcado “Lixo DAPI”. Encher os tubos com os embriões até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.

8.       Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar outros 10 min.

9.       Preparar uma caixa de Petri por grupo com 1% bactoagar em água a cobrir o fundo. Transferir os melhores embriões de cada estádio para esta caixa e, com as pinças, orientá-los da melhor maneira para a posterior captação de imagens. Retirar o excesso de PBS para que os embriões fiquem pousados em cima do agar. Escrever no lado da caixa o estádios HH dos embriões na caixa e indicar os vossos nomes/turma. No caderno, fazer um desenho da caixa indicando a posição e o estádio HH de cada embrião. Se tiverem muitos embriões bons, podem preparar uma segunda caixa.

10.    Levar a caixa de Petri com os embriões para a Unidade de Microscopia (sala 2.1.15;  https://fculmf.campus.ciencias.ulisboa.pt/) e observa-los utilizando a lupa de fluorescência (LUMAR) ou os microscópios de fluorescência (BX60 ou BX61). Faz aquisição de imagens com ajuda do técnico, Luís Marques.

Material: Luvas, PBS (Phosphate Buffered Saline), 5 µg/ml DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol; tóxico),  em PBS, pipetas de Pasteur de ponta fina, pipetas de Pasteur standard, micropipetas e pontas, lupa com iluminador, pinças (grossa/fina), tesoura fina, caixas de Petri, 1% bactoagar em água.

Aula 14

11 Abril 2022, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

O papel das primeiras células do Organizador a entrar na gastrula na padronização das estruturas anteriores nos embriões de anfíbios. As experiências de Otto Mangold. Wnt8 como morfogénio caudalizante e a sua inibição por antagonistas (cerberus, frizbee, dickkopf) segregados pelos derivados do anteriores organizador (endoderme da faringe, mesenquima da cabeça).

O papel das primeiras células do Organizador a entrar na gastrula na padronização das estruturas anteriores. As experiências de Otto Mangold. Wnt8 como morfogénio caudalizante e a sua inibição por antagonistas (cerberus, frizbee, dickkopf) segregados pelos derivados do anteriores organizador (endoderme da faringe, mesenquima da cabeça). Gradiente de actividade Wnt8 na padronização do cérebro. 

Aula 13

7 Abril 2022, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Gastrulação no embrião de anfíbio. Revisão dos principais conceitos. A formação do crescente cinzento, as experiências do Spemann e Mangold (1924) e a descoberta do Organizador. As experiências do Nieuwkoop e a definição do Centro de Nieuwkoop. Os mecanismos moleculares por detrás da indução do Centro de Nieuwkoop, as moléculas do Centro de Nieuwkoop e como essas regulam a ativação do Organizador. As moléculas do Organizador e como padronizam a mesoderme. A expressão dos antagonistas do BMP4 pelo organizador. O BMP4 como agente ventralizante e os seus antagonistas, expressos pelos derivados do Organizador, como contrabalançando o efeito ventralizante, permitindo o desenvolvimento de estruturas dorsais. Comparação com a especificação do eixo dorsal-ventral na Drosophila.