Sumários
Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)
8 Abril 2024, 12:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo
Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)
Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal.
Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.
A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3).
Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.
Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).
Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.
Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.
Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).
Os grupos utilizaram arenas de opção (luz (700-1000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:
w[1118]
w[1118]; ilp7[1]
GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)
GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)
ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4, UAS-Kir2.1)
ppk>txt (ppk-GAL4, UAS-TxT)
Os animais foram condicionados no escuro 10 min antes do ensaio. Após 10 min no escuro (controlo) e após 15 min de exposição à luz (700-1000 lux; ensaio), os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da Dra. Rebeca Zanini como monitora na realização da prática.
Interligação do sistema visual - I e Mini-Teste I
27 Março 2024, 17:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo
Conteúdo: O caminho de um axónio de uma célula ganglionar da retina até o córtex visual; Mapa retinotópico Representação topográfica da retina no córtex pirmário visual; Mecanismos de conexão neuronal - pré-deterinados x seleção pós-conexão; Experimentos de Roger Sperry - salamandras e pré-deterimanção das células ganglionares da retina; Identificação de um sinal repulsor de axónios da retina temporal no tectum posterior Identificação dos gradientes de efrina como o sinal repulsor de axónios da retina temporal no tectum posterior; Biologia molecular do direcionamento axonal; Quiasma ótico; Mecanismo molecular do direcionamento axonal das células ganglionares da retina no quiasma ótico. No final desta aula, foi aplicado o Mini-teste I.
Função Neuronal
27 Março 2024, 14:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo
Nesta aula foi feita uma introdução à transmissão sináptica e o papel da proteína Dinamina neste processo. Foi introduzido o gene shibire de Drosophila e a mutação sensível à temperatura shibire[ts1]. A aula consistiu em observar o comportamento locomotor de animais que expressam shibire[ts1] em células específicas do sistema nervoso quando expostos à uma temperatura >29C. Isso foi feito utilizando animais F1 de cruzamentos entre fêmeas UAS-shibire[ts1] e machos dos stocks GAL4 que os alunos já conheciam das aulas anteriores: ChAT, repo, VGlut e ppk. Adicionalmente foi incluído a linha controlo w[1118] cruzado com UAS-shibire[ts1] que não deveria apresentar nenhuma resposta. Os alunos observaram quais genotipos tinham animais paralizados após 5 min à >29C e registravam a proporção de animais paralizados, bem como recuperados após 10 min à temperatura ambiente numa tabela. Foi feita a síntese de todos os grupos no final da aula seguida de discussão sobre as diferenças entre genotipos. Nomeadamente as linhas ChAT e VGlut tiveram moscas paralizadas e as demais não (ou somente esporadicamente). Foi enfatizada a importância dos controlos experimentais em experimentos na neurogenética e em geral, e a diferença da função dos diferentes grupos neuronais para a locomoção, bem como os limites interpretativos dos experimentos realizados. Redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula contou com a colaboração da Dra. Fabiana Herédia na realização da prática.Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração do William Jandi como monitor na realização da prática.
Função Neuronal
26 Março 2024, 17:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo
Nesta aula foi feita uma introdução à transmissão sináptica e o papel da proteína Dinamina neste processo. Foi introduzido o gene shibire de Drosophila e a mutação sensível à temperatura shibire[ts1]. A aula consistiu em observar o comportamento locomotor de animais que expressam shibire[ts1] em células específicas do sistema nervoso quando expostos à uma temperatura >29C. Isso foi feito utilizando animais F1 de cruzamentos entre fêmeas UAS-shibire[ts1] e machos dos stocks GAL4 que os alunos já conheciam das aulas anteriores: ChAT, repo, VGlut e ppk. Adicionalmente foi incluído a linha controlo w[1118] cruzado com UAS-shibire[ts1] que não deveria apresentar nenhuma resposta. Os alunos observaram quais genotipos tinham animais paralizados após 5 min à >29C e registravam a proporção de animais paralizados, bem como recuperados após 10 min à temperatura ambiente numa tabela. Foi feita a síntese de todos os grupos no final da aula seguida de discussão sobre as diferenças entre genotipos. Nomeadamente as linhas ChAT e VGlut tiveram moscas paralizadas e as demais não (ou somente esporadicamente). Foi enfatizada a importância dos controlos experimentais em experimentos na neurogenética e em geral, e a diferença da função dos diferentes grupos neuronais para a locomoção, bem como os limites interpretativos dos experimentos realizados. Redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula contou com a colaboração da Dra. Fabiana Herédia na realização da prática.Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da mestre Mafalda Gualdino como monitora na realização da prática.
Função Neuronal
25 Março 2024, 17:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo
Nesta aula foi feita uma introdução à transmissão sináptica e o papel da proteína Dinamina neste processo. Foi introduzido o gene shibire de Drosophila e a mutação sensível à temperatura shibire[ts1]. A aula consistiu em observar o comportamento locomotor de animais que expressam shibire[ts1] em células específicas do sistema nervoso quando expostos à uma temperatura >29C. Isso foi feito utilizando animais F1 de cruzamentos entre fêmeas UAS-shibire[ts1] e machos dos stocks GAL4 que os alunos já conheciam das aulas anteriores: ChAT, repo, VGlut e ppk. Adicionalmente foi incluído a linha controlo w[1118] cruzado com UAS-shibire[ts1] que não deveria apresentar nenhuma resposta. Os alunos observaram quais genotipos tinham animais paralizados após 5 min à >29C e registravam a proporção de animais paralizados, bem como recuperados após 10 min à temperatura ambiente numa tabela. Foi feita a síntese de todos os grupos no final da aula seguida de discussão sobre as diferenças entre genotipos. Nomeadamente as linhas ChAT e VGlut tiveram moscas paralizadas e as demais não (ou somente esporadicamente). Foi enfatizada a importância dos controlos experimentais em experimentos na neurogenética e em geral, e a diferença da função dos diferentes grupos neuronais para a locomoção, bem como os limites interpretativos dos experimentos realizados. Redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula contou com a colaboração da Dra. Fabiana Herédia na realização da prática.Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da Dra. Rebeca Zanini como monitora na realização da prática.