Sumários

Sistema vestibular e somatossensação

10 Abril 2024, 17:00 Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

O sistema vestibular - SOMATOSSENSAÇÃO: COMO SENTIMOS MOVIMENTO CORPORAL, TOQUE, TEMPERATURA E DOR? - Sentidos Somáticos (Somestéticos) - Proprioceção (cinestesia) - Termossensação - Tato (mecanossensação cutânea / perceção háptica) - Nociceção (algesia/dor) - Sentido do prurido (pruriception) - Codificação de diversos estímulos somatossensoriais por diferentes tipos de neurónios sensoriais - Propriedades anatómicas e fisiológicas dos neurónios sensoriais - Mecanorecetores - Piezo: identificação e propriedades - Células de Merkel e neurónios sensoriais do toque empregam o canal Piezo2 para a mecanotransdução - Canais TRP: identificação e propriedades - Contribuição dos canais TRP para as sensações químicas, da temperatura e de dor - Sensação do frio e do calor - Integração central da sensação: a distinção entre a coceira e a dor como um exemplo - Recordar córtex somatossensorial primário (homúnculo) - Vias descendentes - Reflexos (recordar reflexo joelho) -


Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)

10 Abril 2024, 14:30 Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I) 


Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal. 


Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.


A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3). 


Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.

Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).


Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.


Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.


Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).

   

Os grupos utilizaram arenas de opção (luz (700-1000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:

w[1118]

w[1118]; ilp7[1]

GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)

GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)

ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4,  UAS-Kir2.1)

ppk>txt (ppk-GAL4,  UAS-TxT)


Os animais foram condicionados no escuro 10 min antes do ensaio. Após 10 min no escuro (controlo) e após 15 min de exposição à luz (700-1000 lux; ensaio), os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da mestre William Jandi como monitor na realização da prática.


Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)

9 Abril 2024, 17:30 Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I) 


Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal. 


Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.


A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3). 


Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.

Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).


Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.


Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.


Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).

   

Os grupos utilizaram arenas de opção (luz (700-1000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:

w[1118]

w[1118]; ilp7[1]

GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)

GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)

ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4,  UAS-Kir2.1)

ppk>txt (ppk-GAL4,  UAS-TxT)


Os animais foram condicionados no escuro 10 min antes do ensaio. Após 10 min no escuro (controlo) e após 15 min de exposição à luz (700-1000 lux; ensaio), os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da mestre Mafalda Gualdino como monitora na realização da prática.


Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)

8 Abril 2024, 17:30 Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I) 


Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal. 


Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.


A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3). 


Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.

Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).


Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.


Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.


Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).

   

Os grupos utilizaram arenas de opção (luz (700-1000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:

w[1118]

w[1118]; ilp7[1]

GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)

GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)

ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4,  UAS-Kir2.1)

ppk>txt (ppk-GAL4,  UAS-TxT)


Os animais foram condicionados no escuro 10 min antes do ensaio. Após 10 min no escuro (controlo) e após 15 min de exposição à luz (700-1000 lux; ensaio), os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula foi dada em conjunto com a Prof. Dra. Fabiana Herédia (a 37.5%) e contou com a colaboração da Dra. Rebeca Zanini como monitora na realização da prática.


Interligação do Sistema Visual II

8 Abril 2024, 16:30 Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Conteúdo:

Papel da experiência e da atividade neuronal nas conexões neuronais. Colunas de dominância no córtex visual V1 de gatos. Período crítico. Experimentos de Hubel & Wiesel: Deprivação monocular durante o desenvolvimento afeta a dominância ocular. Hipótese da competição. Oclusão binocular e a importância de controlos. Estabelecimento de colunas de dominância ocular em sapos que desenvolvem-se com um “terceiro olho”. Colunas de dominância formam-se gradualmente durante o desenvolvimento. Atividade neuronal espontânea é crítica para a formação de colunas de dominância. Ondas retinais - atividade espontânea. Ondas retinais colinérgicas são críticas para a segregação axonal nos núcleos talâmicos. Sincronia das ondas retinais são críticas para a segregação axonal nos núcleos talâmicos. Lei de Hebb – atividade correlacionada fortalece a sinapse. Recetor glutamatérgico NMDA é uma molécula “Hebbiana”: um detetor de coincidências. Outro exemplo da interconexão dependente da atividade: sistema somatossensorial de ratinho. A interconexão dependente da atividade do sistema whisker-barrel de ratinhos depende do recetor NMDA. Formação dos barris corticais no córtex somatossensorial de ratinho. A formação dos barris no córtex somatossensorial de ratinhos depende da atividade neuronal e do recetor NMDA.